......
1. perché è necessario il trasferimento di proteine?
western blot è un metodo in cui le proteine vengono trasferite a una membrana e quindi rilevate utilizzando un anticorpo. per le proteine di espressione note, l'anticorpo corrispondente può essere usato come anticorpo primario per il rilevamento e il prodotto di espressione del nuovo gene può essere rilevato dalla porzione di fusione dell'anticorpo.
il campione di proteine separato per pagina viene trasferito su un veicolo in fase solida (ad esempio una membrana di nitrocellulosa) e il veicolo in fase solida adsorbe la proteina con un legame non covalente e può mantenere il tipo di polipeptide e la sua attività biologica. la proteina o il polipeptide sul veicolo in fase solida viene usato come antigene e l'anticorpo corrispondente è immunoreattivo, quindi viene fatto reagire con l'enzima o l'anticorpo secondario marcato con isotopi e la proteina espressa da un gene specifico viene rilevata dallo sviluppo del colore del substrato o autoradiografia.
2. la ragione e la soluzione del trasferimento incompleto
motivi
il film non è completamente fradicio
utilizzare una membrana permeabile al metanolo al 100%
il peso molecolare della proteina bersaglio è inferiore a 10.000
selezionare una piccola membrana di dimensioni dei pori per abbreviare il tempo di trasferimento
il punto isoelettrico della proteina bersaglio è uguale o vicino al pH del buffer di trasferimento
la concentrazione di metanolo è troppo alta
l'eccessiva concentrazione di metanolo induce la proteina a separarsi dal sds, precipitando in tal modo nel gel, causando il restringimento o l'indurimento del gel, inibendo così il trasferimento di proteine ad alto peso molecolare. ridurre la concentrazione di metanolo o utilizzare invece etanolo o isopropanolo
tempo di trasferimento insufficiente
tempo di trasferimento prolungato per gel densi e proteine ad alto peso molecolare
3. metodo di preparazione pertappi (cas 1135-40-6) buffer
si prega di consultare la seguente tabella (entrambe le concentrazioni di tampone e idrossido di sodio sono 0,1 mol / l):
ph di caps buffer
volume (tappi)
volume (naoh)
6.8
250
0
10.0
218,3
31,7
10.5
178,6
71,4
10.8
156,3
93,7
11.2
138,9
111.1
l'operazione specifica del preparato è: 0,1 mol / lcapsla soluzione tampone viene prima preparata in una beuta volumetrica. durante il processo di configurazione, il tampone deve essere disidratato ad alta temperatura e raffreddato in un essiccatore; Allo stesso tempo viene formulata anche una soluzione di idrossido di sodio 0,1 mol / l. secondo la formula nella tabella sopra, può essere preparata una soluzione tampone corrispondente a pH, e l'idrossido di sodio è principalmente usato per regolare il ph.
il western blotting può essere applicato per rilevare proteine bersaglio da miscele proteiche, determinare quantitativamente o qualitativamente l'espressione di proteine in cellule o tessuti e la successiva analisi di interazioni proteina-proteina, proteina-DNA e proteina-rna. il trasferimento di film è la base di wb e la sua qualità è la chiave del successo di wb. speriamo che i metodi sopra riportati possano aiutarti a riuscire nel processo di transfor.
Copyright © Suzhou Yacoo Science Co., Ltd. Tutti i diritti riservati
Servizio Online
86-15062454963
sales@yacoo.com.cn
