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uso di guanidina cloridrato nella purificazione del corpo di inclusione 2018-07-27 14:20:15

con lo sviluppo della tecnologia di ricombinazione genetica, un numero sempre maggiore di proteine ​​può essere espresso in cellule ospiti esogene. tuttavia, nel processo di espressione, una piegatura errata porta all'aggregazione di proteine ​​per formare un corpo di inclusione. da un lato, possiamo evitare la formazione del corpo di inclusione modificando le condizioni di coltura delle cellule a monte, come ad esempio abbassando la temperatura di espressione, riducendo il tempo di coltura e diminuendo la concentrazione dell'indotto di iptg. tuttavia, se la situazione non può essere modificata, il corpo di inclusione deve essere purificato. eguanidina cloridratosvolge un ruolo enorme nella purificazione del corpo di inclusione.


(1) rottura delle cellule


i batteri sono stati raccolti per la centrifugazione per ottenere corpi di inclusione grezzi.


(2) lavaggio dei corpi di inclusione


i corpi di inclusione sono lavati con un tampone contenente bassa concentrazione di denaturante (come urea 2 m) o nessun agente denaturante, per rimuovere una parte dell'eteroproteina, e il corpo di inclusione purificato è ottenuto per centrifugazione.


(3) scioglimento degli enti di inclusione


i corpi di inclusione purificati vengono solubilizzati usando tampone contenente alta concentrazione di denaturante, come urea 8 m o guanidina cloridrato 6 m.


urea o guanidina cloridrato (cas 50-01-1) hanno diverse abilità per dissolvere i corpi di inclusione. l'urea e la guanidina cloridrato sono agenti denaturanti di intensità moderata, che hanno forti effetti di denaturazione reversibile sul legame idrogeno dei corpi di inclusione, ma la capacità dell'urea è più lenta e debole di quella della guanidina cloridrato. la concentrazione richiesta di urea è generalmente di 8 m, che ha un scarso effetto di dissoluzione su circa un terzo dei corpi di inclusione delle proteine ​​e la solubilità è del 70% ~ 90%; mentre la concentrazione di guanidina cloridrato è solitamente di 6 m, e può dissolvere la maggior parte dei corpi di inclusione, la capacità di dissoluzione è superiore al 95%.


(4) rinaturazione e purificazione


i corpi di inclusione disciolti possono essere rinaturalizzati mediante diluizione o dialisi prima di essere purificati; o purificato e poi rinaturato. in alternativa, la proteina del corpo di inclusione disciolta viene sottoposta a un refolding su colonna per ottenere simultaneamente la rinaturazione e la purificazione. in generale, il setaccio molecolare (sec), la cromatografia chelata di ioni metallici (ni2 +), lo scambio ionico (iex) e idrofobico (hic) possono tollerare alte concentrazioni di denaturante, pertanto per il ripiegamento su colonna possono essere utilizzate diverse tecniche cromatografiche. tuttavia, è necessario prestare attenzione al fatto che l'alta concentrazione del denaturante o di altri componenti nel tampone influenzi l'interazione tra la proteina e il riempitivo.


(5) rilevamento e analisi


infine, il campione ottenuto viene sottoposto a rilevazione e analisi per verificare se si ottiene una proteina naturale. i metodi di rilevamento generale comprendono il rilevamento dell'attività biologica, il dicroismo circolare, la diffusione dinamica della luce o la filtrazione su gel, la cromatografia a fase inversa e così via.


la rinaturalizzazione del corpo di inclusione è un processo molto complicato ed è soggetta a molti fattori. la concentrazione di vari reagenti e proteine ​​nell'esperimento, la temperatura operativa e il tempo di rinaturazione, la composizione del tampone e il valore del pH sono tutti cruciali per i risultati sperimentali. sebbene la guanidina cloridrato presenti carenze come costo elevato, precipitazione in condizioni acide, interferenza con cromatografia a scambio ionico di proteine ​​dopo la rinaturazione nel processo di scioglimento dei corpi di inclusione, la sua solubilità è forte e non causa modificazioni covalenti della proteina ricombinante.



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