Il rapido sviluppo della proteomica negli ultimi anni ci ha portato ad una più profonda comprensione dei meccanismi di proteina e di interazione. La chiave per lo studio della proteomica è l'estrazione di proteine. Questo documento introdurrà l'estrazione della proteina totale da cellule aderenti, cellule sospese e tessuti.

Estrazione della proteina totale (tf) da cellule aderenti

Preparazione di lysate (pH 8.5-9.0): 50mm tris-hcl, 2mm edta, 100mm uv, 0.5% tritone x-100, aggiusta il valore pH a 8.5-9.0; Aggiungere 100 μg / ml di lisozima, 1 μl / ml di inibitori della proteasi pmsf nella soluzione.

Senza trattamento di farmaci:

(1) scartare attentamente il mezzo di coltura e far capovolgere la bottiglia sulla carta assorbente per assorbire il mezzo di coltura;

(2) le cellule sono state lavate con 3 ml di pbs pre-raffreddati (pH da 0,01 a 7,2) e i lavaggi sono stati scartati, ripetuti tre volte e posizionati il ​​pallone sul ghiaccio;

(3) aggiunta di soluzione di lisi, lisazione su ghiaccio per 30 minuti;

(4) le cellule sono state raschiate su un lato del pallone con un raschietto pulito e poi rimosse con un pipetta al tubo di centrifuga;

(5) centrifugazione per 5 minuti a 4 ° c e 12.000 giri / min;

(6) il supernatante è stato trasferito in tubo di centrifuga e conservato a -20 ° c.

Con il trattamento dei farmaci:

A causa dell'impatto delle droghe, alcune cellule cadrebbero nella soluzione, in modo da poter raccogliere anche le cellule del terreno di coltura in aggiunta all'operazione di cui sopra:

(1) versare il mezzo di coltura nel tubo di centrifuga, centrifugare per 5 minuti a 2500 giri / min;

(2) scartare il surnatante, aggiungere una certa quantità di pbs e soffiare delicatamente per lavare con una pipetta e poi centrifugare per 5 minuti, ripetuta una sola volta;

(3) scartare il surnatante, aggiungere la soluzione di lisi e metterlo sul ghiaccio per 30 minuti;

(4) miscelato con il lisato precedente, centrifugando per 5 minuti a 4 ° C e 12.000 giri / min, prendete il surnatante nel tubo di centrifuga e conservate a -20 ° C.

Estrazione della proteina totale dalle cellule di sospensione

(1) le cellule di sospensione sono state precipitate, centrifugate a 2500 rpm per 10 minuti e il supernatante è stato scartato;

(2) aggiungendo un reagente di estrazione della proteina precool contenente inibitore;

(3) agitare per 15 minuti con delicatezza;

(4) centrifugare a 14.000 giri / min per 15 minuti, scartare il precipitato e trasferire immediatamente il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga.

Estrazione della proteina totale nei tessuti

(1) una piccola quantità di tessuto viene collocata in un omogeneizzatore da 1 a 2 ml, tagliato il tessuto in pezzi il più piccolo possibile;

(2) aggiungere 400μl di soluzione di lisi detergente singola nell' homogenizzatore, omogeneato, bagno di ghiaccio;

(3) rendere l'organizzazione il più rotto possibile;

(4) lisi per 30 minuti, il lisato è stato trasferito in un tubo di centrifuga, centrifugato a 12000 rpm e 4 ° C per 5 minuti e il supernatante è stato immagazzinato in tubo di centrifuga a -20 ° C.

L'estrazione del campione proteico è un prerequisito per l'analisi successiva. Il metodo ideale per la separazione delle proteine ​​dovrebbe includere tutte le proteine ​​il più possibile, non inquinante e l'elaborazione successiva è semplificata. Sistema diverso, metodo diverso, quindi dobbiamo scegliere il metodo appropriato per ottenere i migliori risultati dell'analisi.

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