le proteine negli alimenti o nei mangimi cambiano spesso struttura e solubilità a causa del trattamento termico o della reazione chimica durante il processo di lavorazione, con conseguente scarsa solubilità.
I metodi di rilevamento delle proteine divulgati negli standard nazionali comprendono principalmente tre tipi: metodo kjeldahl, spettrofotometria e metodo di combustione. Anche il metodo biureto, il metodo bca, il metodo blu coomassie, il metodo lowry e il metodo ultravioletto sono spesso usati in laboratorio biochimico. i dettagli sono i seguenti:
tabella 1. metodi di rilevamento delle proteine
nome |
metodo |
caratteristiche |
metodo kjeldahl |
(1) decompone la proteina; (2) determina la quantità di ammoniaca per titolazione o sviluppo del colore (3) converte nella quantità totale di proteine |
è ampiamente utilizzato, ma il test richiede molto tempo (di solito 2-4 ore) |
spettrofotometria |
il tempo di rilevamento complessivo è relativamente breve, ma è ancora necessario un passaggio di digestione (circa 1 ora o più) |
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metodo di combustione |
facendo bruciare il campione ad alta temperatura per generare azoto gassoso per determinare la quantità totale di proteine |
il costo del consumo giornaliero è elevato e il flusso di rilevamento del campione è basso. il rilevamento di campioni di proteine su larga scala non è applicabile |
laboratorio biochimico ( metodo del biureto, metodo del bca, metodo del blu di coomassie, metodo di lowry e metodo dei raggi ultravioletti ) |
rilevazione di proteine in campioni di proteine di elevata purezza mediante colorimetria o colorimetria diretta dopo sviluppo di colore chimico |
il tempo di rilevamento è significativamente ridotto, ma richiede che le proteine nel campione siano completamente dissolte e che il sistema cromogenico sia chiarito e privo di interferenze sul percorso ottico. |
pertanto, è urgentemente necessario sviluppare un test in grado di garantire l'accuratezza dei risultati della misurazione, nonché un breve tempo di misurazione e un'ampia gamma di obiettivi di misurazione applicabili (in particolare, possono essere utilizzati direttamente per misurare il contenuto proteico nei campioni contenente proteine scarsamente solubili).
i ricercatori [1] hanno sviluppato un nuovo metodo che comprende le seguenti fasi:
(1) reagente a: dissoluzione alchil solfato di sodio lineare e idrossido di sodio in acqua ad una concentrazione molare di 45 ~ 100 mm e 150 ~ 300 mm, rispettivamente; reagente b: solfato di rame o solfato di rame idrato, tartrato di sodio e idrossido di sodio solubili in acqua in concentrazioni molari di 5 ~ 10 mm, 15 ~ 30 mm e 150 ~ 750 mm;
(2) preparazione dei campioni: utilizzo di acqua priva di proteine o tampone come campione bianco; scioglimento dell'albumina sierica bovina in acqua o Acido 3-morfolinpropanesulfonico (mops) tampone e regolazione della concentrazione della proteina, ottenendo così una serie di soluzioni aventi una concentrazione proteica compresa tra 0,2 mg / ml e 30 mg / ml come campione proteico standard; disperdere il materiale contenente proteine da testare in acqua o tampone e, facoltativamente, mediante processo di diluizione per preparare un campione da testare;
(3) miscelazione del reagente a con un campione bianco, un campione proteico standard e un campione da testare, rispettivamente, per ottenere una miscela corrispondente di reagente, in cui il contenuto proteico nel reagente una miscela del campione da testare soddisfa le requisito di intervallo lineare. e ciascun reagente una miscela viene riscaldata a bagnomaria ad una temperatura di 90 ~ 100 ° C, quindi raffreddata a temperatura ambiente;
(4) miscelare ogni reagente una miscela con il reagente b per ottenere una corrispondente miscela di reagente b, e riscaldare ciascuna miscela di reagente b in un bagno d'acqua a una temperatura di 50 ~ 70 ° C e raffreddare a temperatura ambiente;
(5) filtrando ciascuna delle miscele di reagente b, usando come riferimento la miscela di reagente b del campione bianco raffreddato e misurando la miscela di reagente b del campione di proteine standard raffreddato e il reagente b del campione da testare a 540 nm usando uno spettrofotometro.
(6) in base al contenuto proteico del campione quasi proteico, la relazione tra il contenuto proteico e l'assorbanza è ottenuta mediante adattamento lineare e viene calcolato il contenuto proteico nel campione da testare.
il metodo di rilevamento delle proteine richiede un tempo di rilevamento più breve, aumenta la solubilità delle proteine insolubili, ha una vasta gamma di applicazioni, risultati di misurazione accurati, ampio intervallo lineare, alta sensibilità, alta precisione e buona riproducibilità. inoltre, il metodo di prova è compatibile con accessori e apparecchiature di misurazione ad alto rendimento e può rilevare rapidamente grandi quantità di campioni, rendendolo più adatto a processi industriali su larga scala.
riferimento
metodo di rilevamento delle proteine e kit di rilevamento delle proteine. cn105987884b, 03-03-2015.
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