le proteine ​​sono tipicamente presenti in miscele complesse in tessuti o cellule e pertanto richiedono purificazione in molte applicazioni sperimentali come studi strutturali e analisi biochimiche in vitro. la purificazione delle proteine ​​si basa sulle loro diverse proprietà fisiche per separarsi dalle materie prime al fine di ottenere lo scopo di ottenere le proteine ​​più funzionali. tra questi, la soluzione purificata con proteine ​​ha svolto un ruolo cruciale, quindi quali ingredienti sono necessari nella soluzione?

sistema di buffer

le proteine ​​devono essere conservate in un buon ambiente tampone per prevenire effetti irreversibili sullo stato di folding delle proteine, sulla solubilità e sull'attività. esperimenti biochimici valore ph comunemente usato di 7.4, ma in esperimenti di purificazione di proteine, dovrebbe essere considerato anche il punto isoelettrico della proteina. al punto isoelettrico, le molecole proteiche esistono sotto forma di zwitterions con cariche sia positive che negative e zero cariche nette. le loro particelle possono facilmente collidere e aggregarsi per formare precipitati. pertanto, il ph dovrebbe essere impostato in base al punto isoelettrico della proteina. un buon buffer deve avere le seguenti caratteristiche:

buona compatibilità con altri soluti.

il sistema di buffer comune è mostrato nella seguente tabella:

agente riducente

se la proteina contiene residui di cisteina, l'ossidazione tra i residui di cisteina può causare aggregazione delle proteine. in questo caso, è spesso necessario aggiungere un agente riducente al buffer. agenti riducenti comunemente usati sono β-mercaptoetanolo (bme), ditiotreitolo (dtt) e tris- (2-formil etil) fosfina cloridrato (tcep-hcl). bme contiene un gruppo mercapto, che ha la peggiore riduzione e può mantenere solo 2 ~ 3 giorni. dtt ha due gruppi di mercapto, che è più forte di bme per 3 ~ 7 giorni. la capacità di riduzione di tcep è più forte di quella di bme e dtt, il suo ruolo può essere mantenuto per 2 ~ 3 settimane. tcep non solo ha una forte capacità di riduzione, alta selettività, ma anche più stabile sia in condizioni acide che alcaline.

inibitore della proteasi

inibitori della proteasi in senso lato, si riferisce ai materiali che possono combinarsi con il sito attivo delle molecole della proteasi, in modo che l'attività proteasica diminuisca o addirittura scompaia, ma non per denaturare la proteina enzimatica. viene spesso aggiunto nelle fasi iniziali del tampone di lisi e del processo di purificazione per prevenire l'enzimolisi della proteina bersaglio da parte delle proteasi endogene. inibitori comuni della proteasi sono:

inibitori della leupeptina-serina e della cisteina proteasi;

inibitore della proteasi polipeptide-aspartico inibitorio gastrico;

inibitori della proteasi di pmsf-serina

ci sono altri additivi, come il metallo chelante edta o egta, che può chelare ca2 + o mg2 + per impedire che la proteina bersaglio venga degradata dalla metalloproteasi; arginina chinasi che stabilizzano la struttura proteica e aumentano la solubilità; stabilizzatori ionici, migliorare la solubilità e così via.

la separazione e la purificazione delle proteine ​​è un lavoro complesso e importante, che influisce direttamente sul successo degli esperimenti successivi. tuttavia, non esiste un singolo o un insieme di metodi pronti per estrarre una qualsiasi proteina da una miscela complessa, quindi in pratica è anche necessario che lo sperimentatore esplori le condizioni per scegliere il modo più appropriato per ottenere prodotti di elevata purezza .